鼠来宝生物

免费试用|质粒小提试剂盒

7
发表时间:2023-10-12 15:02作者:鼠来宝实验动物

武汉有度生物科技有限公司开发的试剂现提供免费试用,欢迎咨询!

质粒小提试剂盒说明书

Plasmid Mini Kit Manual

货号:YDD002

详情:www.shulb.com/YOUzol-Reagent.html

产品概述

本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞,再通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA,并最大限度的去除蛋白质、基因组、RNA和其他杂质,最后在低盐、高pH的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱,纯化的质粒DNA可直接用于酶切、PCR、测序、连接、转化、转染一些常规的传代细胞等生物学实验。

产品组分

组分

50 rxns

RNase A

150 μL

Buffer P1

15 mL

Buffer P2

15 mL

Buffer P3

20 mL

Buffer PW1

20 mL

Buffer PW2*

15 mL

EB

15 mL

Spin Column

50

Collection Tubes 2 mL

50

*使用前按瓶上指定体积加入无水乙醇

保存条件

RNase A,-30 ~ -15℃保存,室温运输;其他组分15 ~ 25℃保存,室温运输。

使用方法

1.取1 - 5 mL过夜培养(12 - 16 h)的菌液,加入离心管中(自备),10,000 rpm(11,500 × g)离心1 min。弃培养基,倒扣于吸水纸上吸尽残液。
2.向留有菌体沉淀的离心管中加入250 μL Buffer P1(请先检查Buffer P1是否已经加入RNase A),用移液器或涡旋振荡混匀。
▲本步彻底重悬细菌对产量很关键,重悬后应看不到细菌团块。若有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低。
3.向步骤2中加入250 μL Buffer P2,温和的上下颠倒混匀8 - 10次,使菌体充分裂解。
▲轻轻颠倒混匀。涡旋会引起基因组DNA断裂,造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。此时溶液变得粘稠而透亮,表明细菌已充分裂解。所用时间不要超过5 min,以免质粒受到破坏。若溶液未变清亮,可能由于菌体过多导致裂解不彻底,应适当减少菌体量。
4.向步骤3中加入350 μL Buffer P3,立即温和地上下颠倒8 - 10次让溶液彻底中和Buffer P2。此时应出现白色絮状沉淀。12,000 rpm(13,400 × g)离心10 min。
▲Buffer P3加入后应立即颠倒混匀,以防止产生局部沉淀而影响中和效果。若上清中还有微小白色沉淀,可再次离心后取上清。
5.将Spin Column吸附柱置于Collection Tube 2 mL收集管中。将步骤4上清用移液器小心转移至吸附柱中,注意不要吸到沉淀,12,000 rpm(13,400 × g)离心30 - 60 sec。倒掉收集管中的废液,把吸附柱重新放回收集管中。
6.(可选)加入500 μL Buffer PW1至吸附柱中。12,000 rpm(13,400 × g)离心30 - 60 sec。弃废液,把吸附柱重新放回收集管中。
如果宿主菌是end A+(TG1,BL21,HB101,JM系列,ET12567等),这些宿主菌含有大量的核酸酶,易降解质粒DNA,推荐采用此步。如果宿主菌是endA-宿主菌(DH5α,TOP10等),此步可省略。
7.加入600 μL Buffer PW2(请检查是否已用无水乙醇稀释)至吸附柱中。12,000 rpm(13,400 × g)离心30 - 60 sec。弃废液,将吸附柱重新放回收集管中。
8.重复步骤7。
9.将吸附柱放回收集管中。12,000 rpm(13,400 × g)离心1 min干燥吸附柱,目的是将吸附柱中残留的漂洗液彻底去除。
▲漂洗液中的乙醇残留会影响下游的酶反应,如酶切、酶链、PCR等。此步骤不可省略。
10.把吸附柱置于一个新的灭菌的1.5 mL离心管中。加入30 - 100 μL EB至柱吸附柱的膜中央。室温静置2 min,12,000 rpm(13,400 × g)离心1 min洗脱DNA。
▲洗脱体积不应少于30 μL,低于30 μL会导致洗脱效率下降。若需要获得最高产量,将EB预热至55℃提高洗脱效率。此外可将离心得到的溶液重新加入离心吸附柱中,重复步骤10。若后续做测序需使用ddH2O洗脱,并确保ddH 2O的pH在7.0 - 8.5范围内,pH低于7.0会降低洗脱效率。
11.弃去吸附柱,DNA产物保存于-20℃,以防止DNA降解。

注意事项

1.首次使用前请短暂离心RNase A,将试剂盒提供的RNase A溶液全部加入Buffer P1中,置于4℃保存。
2.首次使用前按Buffer PW2瓶子标签所示,加入适量的无水乙醇稀释Buffer PW2,于室温保存。
3.若低温保存时,Buffer P2、Buffer P3和Buffer PW1溶液容易产生白色沉淀,使用前可室温放置一段时间,必要时可在37℃水浴锅中预热至沉淀完全溶解,混匀后再使用。
4.质粒提取得率和质量与宿主菌的种类、质粒拷贝数,质粒的稳定性等因素有关。
5.注意不要直接接触Buffer P2、Buffer P3和Buffer PW1,使用应戴手套,使用后应立即盖紧盖子。

常见问题及解决方案

低拷贝质粒或大质粒(>10 kb)提取

若所提质粒拷贝数较低或大于10 kb的大质粒,应加大菌体使用量,使用5 - 10 mL过夜培养的菌液,同时按照比例增加Buffer P1、Buffer P2、Buffer P3的用量,洗脱缓冲液EB应在55℃水浴锅预热,同时在吸附和洗脱时可以适当的延长时间,以增加提取效率。其它步骤相同。

DNA产量低

菌种问题:菌种保存过程中存在质粒丢失现象,培养细菌前最好先划线活化,以稳定产量。细菌未充分裂解:细菌须在Buffer P1/RNase A中充分重悬,成团的细菌因无法裂解会降低产量。

试剂准备有误:Buffer P2若有沉淀析出需加热溶解。Buffer PW2加入乙醇体积不准确(乙醇浓度需控制在80%)。

长片段质粒DNA:长片段质粒常以中低拷贝数为主,可提升菌液用量至10 mL以提高产量。将EB预热至55℃,并重复二次洗脱。

基因组污染

培养时间太长:菌液培养时间需控制在12 - 16 h。

裂解问题:加入Buffer P2时,必须轻柔颠倒混匀;处理多个样品时,加入Buffer P2时算起,总时间不要超过5 min。

下游结果不理想

盐污染:确保用Buffer PW2洗涤两次。

乙醇污染:在最后一次Buffer PW2洗涤后可将吸附柱离心时间由原来1 min增加至2 min。

质粒降解:用endA+的菌株如HB101或其它野生型菌株,含有高丰度的核酸酶,必须加入Buffer PW1。

膜脱落:在洗脱质粒时硅胶膜在离心过程中可能会发生脱落。10,000 rpm(11,500 × g)离心2 min后再把质粒转移至新的离心管中。

实验结果示例

图片


分享到:
友情链接:
联系电话:027-87707448  总部湖北省武汉市洪山区关山街道珞喻东路4号慧谷时空2508,分部实验基地:鄂州市华容区东湖高新智慧城11栋
website qrcode

手机网站

微信公众号
会员登录
登录
其他账号登录:
我的资料
我的收藏
留言
回到顶部