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熬夜防痴呆?细谈阿尔茨海默症与小鼠模型

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发表时间:2022-10-31 20:01作者:郑芒
7月21日,《科学》期刊发表重磅调查报告,指出2006年《自然》的一项关于阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,简称AD)发病机制的Aβ56奠基性研究[1]涉嫌图片造假等学术不端。消息一出,舆论哗然,不少媒体纷纷惊呼全世界十六年来的相关研究因此被误导,数千亿美元的研发经费打了水漂……
9月28日,美国药企渤健(Biogen)和日本制药巨头卫材(Eisai)公司宣布,由他们联合研发的药物Lecanemab(仑卡奈单抗)在III期临床试验中取得了较好的结果,接受Lecanemab治疗的早期阿尔茨海默症患者一年半后相比安慰剂对照组认知功能下降减缓27%,成为首个明确能够改善AD症状的药物[2]!

对于已命名百余年、发病机制却依然不清晰的阿尔茨海默症,新药为患者带来了曙光。不过必须承认,目前的科学研究和药物开发进度距离治愈AD依然十分遥远。在此,鼠来宝生物精心梳理了关于AD的部分重要信息,并介绍一些重要的小鼠模型,希望能帮到感兴趣的读者。

1. 阿尔茨海默症概况

阿尔茨海默症是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。该病以认知功能障碍为主要特征,表现为记忆力、判断力、注意力以及语言能力等受损,患者还会出现焦虑、抑郁和冷漠等情绪,严重影响正常生活[3]。

阿尔茨海默症由于多发于老年人,也常被大众称为“老年痴呆”。目前学术界通常约定,65岁以前发病者称早老性痴呆;65岁以后发病者称老年性痴呆。

目前全球有约5500万痴呆患者,其中一半左右患有阿尔茨海默症。根据世界卫生组织数据,在2019年,阿尔茨海默症和其它形式的痴呆症在主要死亡原因中列第7位。其中,妇女受到的影响更大,占比65%[4]。

上海交通大学医学院附属瑞金医院牵头撰写的《中国阿尔茨海默症报告2021》显示,2019年我国阿尔茨海默症患者人数为1314万例,约占全球的25.5%,并且中国的阿尔茨海默症及其他痴呆的患病率、死亡率均略高于全球平均水平。2020年,首都医科大学宣武医院贾建平教授团队的系列研究发现,中国60岁以上人群的痴呆患病率高达6.04%[5]。

阿尔茨海默症整个病程会长达8-10年,随着肉体和精神的逐渐衰弱,直至失能失智最终去世。所以人们常说,阿尔茨海默症患者会经历两次死亡,一次是精神上的,一次是肉体上的。

2. 致病机制

尽管阿尔茨海默症给人类造成了巨大的痛苦,科学家和医务工作者也付出了不懈的努力,但其病因和发病机理迄今尚未明确,药物开发工作也只是基于几个较为流行的假说。

阿尔茨海默症的多重模型[6] 。晚发型阿尔茨海默症(late-onset AD, LOAD)的病因涉及生理层面的老化、免疫挑战和血管改变,细胞层面与神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞和血管内皮细胞有关,而在具体的细胞内代谢层面与Aβ(β-淀粉样蛋白)、Tau蛋白、蛋白泛素化、胆固醇代谢、胞吞作用、免疫应激与血管运输营养物质等环节的异常关联。

《自然·神经科学》期刊2017年发布一则短片[7],简要介绍了当前关于阿尔茨海默症致病机理最流行的假说:Aβ和tau蛋白假说。我们译制了视频,希望能帮读者形成一个生动的初步印象。



初识阿尔茨海默症(来源:nature video)

2019年9月26日,美国华盛顿大学David M. Holtzman团队在顶级期刊《Cell》发表题为“Alzheimer Disease: An Update on Pathobiology and Treatment Strategies”(阿尔茨海默症:病理生物学和治疗策略的最新进展)的综述论文[8],回顾了对AD病理生物学理解的最新进展,并讨论了当前的治疗策略,重点介绍了最新的临床试验和开发未来疾病修饰疗法的机会。我们将主要借助这篇论文为大家详细解读目前研究人员对AD致病机制的理解。

2.1 与临床病程相关的主要病理特征时间线

1.阿尔茨海默症主要症状的时间线.png

长期的临床前阶段以淀粉样蛋白沉积的早期发作为特征。这是通过脑脊液和血浆中Aβ42水平的降低或淀粉样蛋白PET(正电子发射断层扫描)成像上的全局信号增加来检测的。同时,还有早期的神经炎症变化(如小胶质细胞活化)。尽管需要更好的试剂,但可以通过PK11195 PET成像纵向(时间维度)检测小胶质细胞增生。随后是神经纤维缠结(NFT)tau病理从内侧颞叶扩散到新皮质。在患者中,tau的PET成像信号的增加和脑脊液中磷酸化tau水平的增加标志着这种变化。突触功能障碍、突触丧失和神经退化随着tau聚集体的病理扩散而累积。海马和皮质体积的成像分析允许纵向跟踪神经退行性改变。认知障碍的发生和发展与tau的积累和海马体积损失相关,但与淀粉样蛋白沉积无关。阿尔茨海默症临床症状的发作和严重程度可通过使用临床痴呆分级(Clinical Dementia Rating , CDR)量表进行分级,其中0分表示认知正常,0.5分、1分、2分和3分依次表示可疑、轻度、中度和重度痴呆。

2.2 Aβ和tau的作用示例

2.Aβ和Tau在阿尔茨海默症中的作用.png

A. Aβ由APP蛋白通过BACE1和γ-分泌酶的蛋白水解功能产生。BACE1和APP共同定位于内涵体,也就是细胞内Aβ产生的位置。Aβ通过一条在神经元活动中增强的途径分泌到细胞间隙液中。分泌后,Aβ聚集成更规则的低聚物和原纤维,并对细胞功能产生多种影响,包括突触活性受损和突触丢失、大脑毛细血管血流减少,以及通过刺激tau过磷酸化和其它途径直接促进tau病理。

B. 内侧颞叶的病理性tau聚集(蓝色阴影)随着年龄增长而发生,并不总是与认知障碍(原发性年龄相关的tau蛋白病)相关。Aβ沉积的最早积聚(红色阴影)发生在楔前叶(precuneus)和扣带回后部(posterior cingulate)。时间纵向的脑脊液和成像生物标记物研究表明,在阿尔茨海默症中,tau从内侧颞叶向其它皮质区域的病理扩散需要全局的淀粉样蛋白积累。因此,阿尔茨海默症可能代表一种淀粉样蛋白促进的tau蛋白病。

C. 阿尔茨海默症中tau聚集体的病理扩散通常以一种定型的方式沿着神经解剖连接的网络发生。错误折叠的tau可能以类似朊病毒的方式促进天然单体的模板化错误折叠,导致新的病理性tau聚集体的播种。Tau病理随后可以通过突触传播到远处的神经元,这代表了在人类阿尔茨海默症脑中发现的病理性tau传播的分子相关性。

2.3 ApoE的作用假说

3.ApoE在阿尔茨海默症病理中作用的假说V2.png

A. ApoE增强了Aβ的播种和纤维化,导致淀粉样蛋白沉积增强。ApoE(特别是E4)通过与胶质细胞上的Aβ受体竞争性结合,阻止Aβ从脑实质中清除。

B. ApoE(尤其是E4)增强了tau的致病性。ApoE的存在导致小胶质细胞增生增加,以及胶质细胞释放的神经炎性细胞因子的强化,最终导致tau介导神经变性的恶化。

C. ApoE调节小胶质细胞对淀粉样斑块的反应。ApoE存在时,吞噬功能活跃的“疾病相关小胶质细胞”(disease-associated microglia, DAM)和“神经变性表型小胶质细胞”(microglial neurodegenerative phenotype, MGnD)位于斑块附近。紧密的小胶质细胞聚集导致斑块压实。ApoE缺失时,斑块周围的小胶质细胞稀疏,淀粉样斑块变大、变疏松。神经突营养不良显著恶化。另一方面,如果ApoE水平较低但不缺失,则神经突营养不良减轻。

D. ApoE可能通过对神经元和神经元网络活动的直接影响而参与阿尔茨海默症的病理生理。在培养的细胞上,外源提供的ApoE4抑制神经突起的生长,而ApoE3不会。ApoE4也推动了神经元网络活动的功能失调,这可以通过减少的肝门GABA能中间神经元、增加的海马体的网络活动以及ApoE4靶向替代小鼠的癫痫发作倾向来证明。

E. ApoE4可能由于未能有效结合在周细胞等细胞上表达的LRP1 (Low density lipoprotein receptor-related protein 1, 低密度脂蛋白受体相关蛋白1) 而直接损害AD中的血脑屏障(BBB)功能。有证据表明,这引发了亲环素A信号通路的激活增加、血脑屏障的最终破裂,导致血清蛋白(如纤维蛋白)进入脑实质,最终导致神经元死亡。

2.4 先天免疫系统的作用示例

4.先天免疫系统在阿尔茨海默症病理生理中的作用示例.png

A. 从患有淀粉样病变的小鼠中分离的小胶质细胞的转录组分析表明,只有在患病动物中才发现一种独特的小胶质细胞亚群(DAM或MGnD),其特征是稳态基因表达减少,以及吞噬和小胶质细胞活化相关基因表达增加。ApoE和TREM2的表达对于该疾病特异性细胞亚群的发育是必要的。

B. 根据已研究的主要病理学数据,小胶质细胞活化和吞噬功能具有不同的作用。TREM2 KO导致的小胶质细胞表型的活性和吞噬能力较弱。在淀粉样沉积的小鼠模型中,TREM2 KO导致斑块周围小胶质细胞聚集减少,Aβ种子和沉积增加,以及斑块相关tau病理增强的营养不良神经突增加。

C. 相反,在PS19 tau病小鼠中,TREM2 KO导致神经变性和小胶质细胞增生减少。

D. Aβ被吞噬导致小胶质细胞活化增加。Aβ引起的溶酶体损伤可引发NLRP3炎性小体活化,导致IL-1β分泌。从活化的小胶质细胞释放的细胞外ASC斑点可以进一步作为种子交叉诱导Aβ成为纤维。

3. 动物和细胞模型

由于人类不可能被轻易用于开展探索性实验,现在的疾病机理和治疗研究绝大多数时候依赖于动物或细胞模型对于人类疾病在一定程度上的模拟。

3.1 主要模型示意图

阿尔茨海默症模型分类V2.png

Drummond和Wisniewski于2017年总结了当时用于阿尔茨海默症研究的的动物和细胞模型[9]。只有不到1%的AD病例是由APP、PSEN1或PSEN2的常染色体显性突变引起的早发家族性阿尔茨海默症(EOAD)病例。然而,几乎所有主要的转基因啮齿动物模型都表达这些突变形式的APP和PSEN。可获得的散发性AD最佳动物模型是非人灵长类动物。方框中显示了每类模型中一致存在的神经病理:P斑块、CAA嗜刚果红淀粉样血管病、T神经纤维缠结。Drummond等认为这些动物模型中存在缠结前病变不足以预测神经纤维缠结病变的出现。因此,只有3xTg小鼠表现出AD的所有三种病理特征。每一分类中列出的特定品系动物模型是当时AD研究中最常见的动物模型主要示例。

3.2 转基因动物和细胞模型

Xueyuan Li等2016年论文基于相关基因梳理了当时应用广泛的动物模型和体外细胞模型[10]:

3.2.1 转基因动物模型

目前应用最广泛的AD动物模型是模拟人类基因突变的转基因小鼠和大鼠。

模型-转基因动物模型.png


3.2.2 非转基因动物模型

自然发生或食物、化学、手术诱导的大鼠、小鼠、犬和猴模型。

模型-非转基因动物模型-Ref.png


3.2.3 体外实验模型

脑切片、诱导多能干细胞、神经母细胞瘤细胞等体外模型。

模型-体外模型-Ref.png


4. 小鼠模型

由于小鼠与人类基因相似度约85%,两者在基因与表型层面有很多共通之处,在小鼠身上获得的实验数据参考价值较高。另外,小鼠繁殖能力强、体型小,在屏障饲养条件下寿命为1.5-2年,较容易观察其在老年阶段的生理病理现象。比如在18-24月龄的C57BL/6小鼠(不同品系的小鼠表型有所不同)体内,几乎所有衰老相关生物标记物都可以检测到衰老变化[11]。所以,目前应用最广泛的AD动物模型是模拟人类基因突变的转基因小鼠。

4.1 关键蛋白的结构差异

关键分子APP、tau、APOE的结构区别.png

由于基因组上的差异,人类和小鼠基因功能通常难以进行完全匹配的简单对应。上图展示了阿尔茨海默症相关的三个关键蛋白在人类与小鼠间的结构差异[12],研究者在开发转基因小鼠时需要注意这些区别。

Tau是神经元轴突中富含的一种蛋白质。在人类中,它被发现有六种亚型,其氨基末端重复(0N、1N或2N)和微管结合重复(3R或4R)的数量不同。在成年小鼠脑中,三种N亚型(0N、1N或2N)与4R重复组合存在。

人类神经元表达的淀粉样前体蛋白(APP)是一种695个氨基酸的蛋白质,其高度淀粉样裂解产物淀粉样蛋白-β(Aβ)代表性的长度为42个氨基酸,且与小鼠相比,人类Aβ存在3个氨基酸差异(R5G、Y10F和H13R)。Aβ有众多单体片段,研究最多的包括Aβ*42和Aβ*40等,而不是本文开头提到的被质疑2006年论文研究的Aβ*56这种较为冷门而特殊的β淀粉样蛋白寡聚体。专业人士认为,即便那篇论文中的图像确认造假,对相关研究的影响也有限,不会撼动β淀粉样蛋白假说目前的主流地位。事实上,不少以Aβ为靶标的单抗药物在临床试验中都有不俗的表现。因此,舆论所传“导致全球研究被误导十六年”实在是过于夸张了。

载脂蛋白E(APOE)在人和小鼠中具有相似的长度;然而,在人类中有三种常见的APOE变体,分别在112和158位含有半胱氨酸(C)或精氨酸(R)残基,出现C-C、C-R和R-R组合。

许多流行的小鼠模型就是引入了上述关键蛋白APP、tau和ApoE的突变,此外还有更多导入了通过患者病理样本测序等方法检测到的、或预测的其它基因的可疑突变位点。

4.2 模型制作流程

选定需要修改的基因靶点后,就需要通过适当的基因编辑技术将修改后的序列稳定整合进小鼠基因组,得到预期的转基因小鼠模型。迄今运用的主流技术的基本流程如下:

构建转基因大小鼠的流程V2.png

A.传统的转基因模型制作是将感兴趣的基因和特定的启动子组合并通过原核注射传递到受精卵中。

B.基于同源介导重组(homology-directed recombination, HDR)机制的模型通常采用两种路径:(1)经典方法使用靶向载体,包含需要插入宿主基因组的序列(其侧翼有与感兴趣的受体基因组位点相对应的同源臂),并包含选择标记(通常是抗生素抗性基因)。首先,将靶向载体导入胚胎干细胞,然后挑选表达了转基因的胚胎干细胞,再将其显微注射到囊胚中。(2)通过基因编辑(例如TALEN或CRISPR)技术获得的模型,将含有同源臂的供体模板与方法特异性成分(分别为TALEN或Cas9酶和引导RNA分子)一起注射到合子的原核中,可以在特定位点引起基因组DNA的断裂和重新连接,将供体模板插入受体基因组。

上述三种方法的后续共同步骤是,将注射的受精卵或囊胚移植到假孕雌性体内,以获得幼崽。这些幼崽会经过对所需基因组修饰的表达(嵌合、杂合或纯合)的筛选,然后用于扩大种群建立新的动物品系。

4.3 模型数据库

数十年来,科学家们已经开发了上百个阿尔茨海默症的小鼠和大鼠模型,如何整理和运用已经积累的海量数据就成为一件重要的任务。据我们所知,Alzforum.org网站是AD小鼠模型收录最完整、使用最方便的数据库之一。随后我们将简单介绍一下这个网站的使用方法,供读者参考。

4.3.1 模型查询

Alzforum收录了283个神经退行性疾病的啮齿动物(小鼠、大鼠)模型。除阿尔茨海默症外,网站也整理了渐冻症 (Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS)、淀粉样脑血管病 (Cerebral Amyloid Angiopathy, CAA)、额颞痴呆 (Frontotemporal Dementia, FTD)、帕金森病 (Parkinson’s Disease, PD)和Nasu-Hakola病 (Nasu-Hakola Disease, NHD)等神经退行性疾病的模型。

在Search research models窗口(www.alzforum.org/research-models),用户可以在物种、疾病、基因和模型类型分类中勾选感兴趣的项目,还可以手动输入关键词(keyword)快速筛选出相应的动物模型。

如下图所示,AD相关的动物模型有214个,其中小鼠模型197个。

Alzforum - AD小鼠模型197个.jpg

对于查询所得的动物模型列表,用户可以通过”MODIFY TABLE”修改展示信息,还可以在勾选感兴趣的品系后点击”COMPARE SELECTED MODELS”,更便捷地比较不同模型的差异。

Alzforum - Modify table.jpg


4.3.2 表型查询

“阿尔茨海默症常用小鼠”页面 (Alzheimer's Disease Commonly Used Mouse Models Alzforum, www.alzforum.org/research-models/alzheimers-disease/commonly-used) 以交互图形方式将有明确报道的小鼠模型按照表型及出现时期进行聚类展示。

常用小鼠的选定表型V2.png

用户在关注的表型和时期处点击数字,即可弹出如下图所示的具体品系信息:

Alzforum - 表型查询 - 弹窗.jpg


点击某一品系即可跳转至其详情页面,或者点击”VISUALIZE THESE”查看所列品系的可视化对比。

Alzforum - 表型查询 - VISUALIZE THESE.jpg


4.3.3 突变查询:列表

突变数据库(www.alzforum.org/mutations) 收录了与常染色体显性AD相关的三个基因(APP、PSEN1、PSEN2)以及通过遗传或编码蛋白的神经病理学与AD相关的两个基因(TREM2和MAPT)的基因变异库。数据库罗列了这些基因的从常见到罕见、致病到良性的变异,并依据文献所述简要描述相关的临床和神经病理学特征以及报告的功能影响。

Alzforum - Search mutations.jpg

Alzforum - Search mutations - Results.jpg

4.3.4 突变查询:交互图形

除列表外,数据库还以交互式图形展示不同基因的突变位点,使分析更形象。以APP蛋白为例(www.alzforum.org/mutations/app),其图形体现了该蛋白的跨膜结构和每一个氨基酸的已知突变。

APP_20220531_00.png


点击感兴趣的氨基酸即可查看相关突变记录,继续点击即进入详情界面,提供了相当流畅的使用体验。

APP-氨基酸.png

4.4 模型示例

现在,我们以APP、MAPT和PSEN1三个基因均发生突变的3xTg模型为例,介绍Alzforum提供的信息(www.alzforum.org/research-models/3xtg)。

3xTg - Research Model.png

Name 名称、Synonyms 别名
Overview 纵览(Species 物种、Genes 基因、Mutations 突变、Modification 基因修饰、Disease Relevance 相关疾病、Strain Name 品系完整名称、Genetic Background 遗传背景、Availability 获取途径)
Summary 概要
Neuropathology 神经病理
Cognition/Behavior 认知/行为
Modification Details 修饰细节
Note 备注
Related Strains 相关品系
Phenotype Characterization 表型特征(Plaques 斑块、Tangles 缠结、Neuronal Loss 神经损失、Gliosis 胶质细胞增生、Synaptic Loss 突触损失、Changes in LTP/LTD 长时程增强/长时程抑制改变、Cognitive Impairment 认知损害)
Comments / Questions 评论和问题
References 引用资料
Further Reading 拓展阅读

3xTg Phenotype.jpg


用户可以在详情页面找到完整的数据,并通过引用资料追溯数据的来源,在拓展阅读了解后续进展。

5. 鼠来宝生物AD小鼠模型

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鼠来宝生物AD小鼠模型.png

师弟:师兄,我看网上好像说经常熬夜可以预防老年痴呆?


师兄:是的,因为那可以预防你……活到老年

我刚刚要搜啥来着?.jpg

6. 参考资料

[1] Lesné, S. et al. A specific amyloid-β protein assembly in the brain impairs memory. Nature 440, 352–357 (2006).

https://www.nature.com/articles/nature04533

[2] 白露. 阿尔茨海默症临床重大突破,Science解读新疗法5大关键问题. 医药魔方Pro. 2022-10-10.

https://mp.weixin.qq.com/s/xFd-GPPPxEuHUftyffdxYQ

[3] Alzheimer's Disease International (ADI) (alzint.org). About Alzheimer’s & Dementia. 2022-10-19.

https://www.alzint.org/about/

[4] 世界卫生组织. 前十位死亡原因. 2020-12-09.

https://www.who.int/zh/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death

[5] 大众日报. 数据说丨世界阿尔茨海默症日:致“脑海中的橡皮擦” . 2022-09-21

https://www.sohu.com/a/586767646_121345914

[6] Sims, R., Hill, M. & Williams, J. The multiplex model of the genetics of Alzheimer’s disease. Nat Neurosci 23, 311–322 (2020).

https://www.nature.com/articles/s41593-020-0599-5

[7] Nature video. Inside Alzheimer’s disease. 2017-01-03.

https://www.youtube.com/watch?v=zTd0-A5yDZI

[8] Long, J. M. & Holtzman, D. M. Alzheimer Disease: An Update on Pathobiology and Treatment Strategies. Cell 179, 312–339 (2019).

https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092867419310074

[9] Drummond, E. & Wisniewski, T. Alzheimer’s disease: experimental models and reality. Acta Neuropathol 133, 155–175 (2017).

https://link.springer.com/article/10.1007/s00401-016-1662-x

[10] Li, X., Bao, X. & Wang, R. Experimental models of Alzheimer’s disease for deciphering the pathogenesis and therapeutic screening (Review). International Journal of Molecular Medicine 37, 271–283 (2016).

https://www.spandidos-publications.com/10.3892/ijmm.2015.2428

[11] Flurkey, Currer, and Harrison, 2007. ‘The mouse in biomedical research.’ in James G. Fox (ed.), American College of Laboratory Animal Medicine series (Elsevier, AP: Amsterdam; Boston).

[12] Götz, J., Bodea, L.-G. & Goedert, M. Rodent models for Alzheimer disease. Nat Rev Neurosci 19, 583–598 (2018).

http://www.nature.com/articles/s41583-018-0054-8

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