YOUzol Reagent（总RNA提取试剂）说明书
产品简介
本产品基于异硫氰酸胍和酚，具有极强的裂解能力，可在短时间内裂解细胞和组织样本，保证RNA的完整性。本产品广泛适用于培养细胞、动物组织、微生物等。样品在YOUzol Reagent中能够充分被裂解，在加入氯仿离心后，溶液会形成上清层、中间层和有机层，RNA分布在上层水相中，收集上清层后，经异丙醇沉淀便可以回收得到总RNA。
产品组分
组分 | 规格 |
YOUzol Reagent（总RNA提取试剂） | 100 mL |
保存条件
2 ~ 8°C避光保存。
适用范围
适用于动物组织、细胞、病毒、微生物等样本。
自备试剂
氯仿（三氯甲烷）、异丙醇、无水乙醇，RNase-free ddH2O。
注意事项
本产品中含有苯酚，具有毒性和腐蚀性，使用时应穿戴防护物品。如果不慎接触到眼睛，应立即用大量的水冲洗并前往医院治疗；接触到皮肤，请立即用大量去垢剂和水冲洗，如仍有不适，请前往医院治疗。
操作流程
实验准备
RNA的提取关键在于防止RNase污染，该污染会导致提取的RNA的降解，因此实验应在干净独立的实验台进行，佩戴口罩手套，所用试剂耗材应无RNase，所用离心机提前4℃预冷30 min，实验过程避免讲话，且全程保持实验环境的洁净。
实验步骤
1.细胞裂解或组织匀浆。
贴壁细胞：吸尽培养液，每10 cm2细胞加入1mL YOUzol Reagent。一般六孔板每孔加1 mL YOUzol Reagent，12孔板每孔加0.5 mL YOUzol Reagent。晃动3-5下，再用枪吹打2-3下，确保全部裂解，然后吸至离心管中。
悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，每五百万至一千万动植物或酵母细胞，或一千万细菌，加入1 mL YOUzol Reagent。用枪吹打或适当涡旋震荡，确保全部裂解。某些酵母和细菌如裂解不充分，可用匀浆器匀浆，确保全部裂解。
组织：先将组织剪切成小块，放入普通玻璃匀浆器内。每50 mg-80 mg组织加入1 mL YOUzol Reagent，匀浆。对于RNA完整性要求比较高的情况，推荐先液氮冷冻组织块，然后在低温下用研钵研碎组织，随后再加入YOUzol Reagent进行总RNA抽提。
2. 对于某些蛋白，多糖或脂含量很高的细胞或组织，YOUzol Reagent裂解后可能会有不溶物或油脂状漂浮物。需12000 rpm 4ºC离心10min，然后吸取澄清的YOUzol Reagent裂解产物至一新的离心管中。
3. 冰上放置5 min，使样品充分裂解。
4. 每毫升YOUzol Reagent加入0.2 mL氯仿，涡旋震荡混匀或猛烈晃动15秒，冰上放置5 min
5. 12 000 rpm 4ºC离心15 min，然后小心吸取上层水相至一新的离心管中。
6. 加入等体积的异丙醇，颠倒数次混匀，冰上沉淀10 min。
7. 12 000 rpm 4ºC离心10 min，在管底可见RNA沉淀，弃上清。
8. 加入0.5 mL 75%乙醇(DEPC水配制)，颠倒混匀以清洗RNA沉淀，7 500 rpm 4ºC离心5 min，弃上清，重复该步骤一次，小心吸尽液体。
9. 室温晾干（5 min左右，切勿让RNA过分干燥，否则将极难溶解），加入DEPC水溶解RNA沉淀，-20℃可保存数周，-80ºC可长期保存。
产物检测
1. 纯度及浓度检测
分光光度计检测RNA纯度和浓度，OD260/OD280比值在1.8~2.2之间表明RNA纯度较高。
2. 完整性检测
取0.5 - 1 μg RNA，用RNase-free ddH2O稀释至8 μL，再加入1 μL 10 × DNA loading buffer，混匀，进行1%琼脂糖凝胶电泳。
常见问题及解决方案
1. 提取的RNA发生降解。
确保提取的过程无RNase污染。
2. 提取样本有基因组DNA污染。
向裂解液中加入氯仿后，需要在低温下(2 ~ 8°C)高速离心。离心后，RNA被抽提到上层的水相中，下层是有机相，含有氯仿，DNA即存在于中层。氯仿在常温下会与水以一定的比例互溶，因此，常温离心会导致上层水相中也有少量基因组DNA污染。吸取上层液时，应非常小心，避免吸到中间层和下层，为此牺牲一点得率，保留一些上清不吸。
版本：V231009
