质粒小提试剂盒说明书
Plasmid Mini Kit Manual
产品概述
本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，再通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA。并最大限度的去除蛋白质、基因组、RNA和其他杂质，最后在低盐、高pH的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱，纯化的质粒DNA可直接用于酶切、PCR、测序、连接、转化、转染一些常规的传代细胞等生物学实验。
产品组分
组分 | 50 rxns |
RNase A | 150 μL |
Buffer P1 | 15 mL |
Buffer P2 | 15 mL |
Buffer P3 | 20 mL |
Buffer PW1 | 20 mL |
Buffer PW2* | 15 mL |
EB | 15 mL |
Spin Column | 50个 |
Collection Tubes 2 mL | 50个 |
*使用前按瓶上指定体积加入无水乙醇
保存条件
RNase A，-30 ~ -15℃保存，室温运输；其他组分15 ~ 25℃保存，室温运输。
使用方法
1. 取1 - 5 mL过夜培养(12 - 16 h)的菌液，加入离心管中(自备)，10,000 rpm(11,500 × g)离心1 min。弃培养基，倒扣于吸水纸上吸尽残液。
2. 向留有菌体沉淀的离心管中加入250 μL Buffer P1(请先检查Buffer P1是否已经加入RNase A)，用移液器或涡旋振荡混匀。
▲本步彻底重悬细菌对产量很关键，重悬后应看不到细菌团块。若有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，
导致提取量和纯度偏低。
3. 向步骤2中加入250 μL Buffer P2，温和的上下颠倒混匀8 - 10次，使菌体充分裂解。
▲轻轻颠倒混匀。涡旋会引起基因组DNA断裂，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。此时溶液变得粘稠而透亮，表明细菌已充分裂解。所用时间不要超过5 min，以免质粒受到破坏。若溶液未变清亮，可能由于菌体过多导致裂解不彻底，应适当减少菌体量。
4. 向步骤3中加入350 μL Buffer P3，立即温和地上下颠倒8 - 10次让溶液彻底中和Buffer P2。此时应出现白色絮状沉淀。12,000 rpm(13,400 × g)离心10 min。
▲Buffer P3加入后应立即颠倒混匀，以防止产生局部沉淀而影响中和效果。若上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
5. 将Spin Column吸附柱置于Collection Tube 2 mL收集管中。将步骤4上清用移液器小心转移至吸附柱中，注意不要吸到沉淀，12,000 rpm(13,400 × g)离心30 - 60 sec。倒掉收集管中的废液，把吸附柱重新放回收集管中。
6. (可选)加入500 μL Buffer PW1至吸附柱中。12,000 rpm(13,400 × g)离心30 - 60 sec。弃废液，把吸附柱重新放回收集管中。
▲如果宿主菌是end A+(TG1，BL21，HB101，JM系列，ET12567等)，这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。如果宿主菌是endA-宿主菌(DH5α，TOP10等)，此步可省略。
7. 加入600 μL Buffer PW2(请检查是否已用无水乙醇稀释)至吸附柱中。12,000 rpm(13,400 × g)离心30 - 60 sec。弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。
8. 重复步骤7。
9. 将吸附柱放回收集管中。12,000 rpm(13,400 × g)离心1 min干燥吸附柱，目的是将吸附柱中残留的漂洗液彻底去除。
▲漂洗液中的乙醇残留会影响下游的酶反应，如酶切、酶链、PCR等。此步骤不可省略。
10. 把吸附柱置于一个新的灭菌的1.5 mL离心管中。加入30 - 100 μL EB至柱吸附柱的膜中央。室温静置2 min，12,000 rpm(13,400 × g)离心1 min洗脱DNA。
▲洗脱体积不应少于30 μL，低于30 μL会导致洗脱效率下降。若需要获得最高产量，将EB预热至55℃提高洗脱效率。此外可将离心得到的溶液重新加入离心吸附柱中，重复步骤10。若后续做测序需使用ddH2O洗脱，并确保ddH 2O的pH在7.0 - 8.5范围内，pH低于7.0会降低洗脱效率。
11. 弃去吸附柱，DNA产物保存于-20℃，以防止DNA降解。
注意事项
1. 首次使用前请短暂离心RNase A，将试剂盒提供的RNase A溶液全部加入Buffer P1中，置于4℃保存。
2. 首次使用前按Buffer PW2瓶子标签所示，加入适量的无水乙醇稀释Buffer PW2，于室温保存。
3. 若低温保存时，Buffer P2、Buffer P3和Buffer PW1溶液容易产生白色沉淀，使用前可室温放置一段时间，必要时可在37℃水浴锅中预热至沉淀完全溶解，混匀后再使用。
4. 质粒提取得率和质量与宿主菌的种类、质粒拷贝数，质粒的稳定性等因素有关。
5. 注意不要直接接触Buffer P2、Buffer P3和Buffer PW1，使用应戴手套，使用后应立即盖紧盖子。
常见问题及解决方案
低拷贝质粒或大质粒（>10 kb）提取
若所提质粒拷贝数较低或大于10 kb的大质粒，应加大菌体使用量，使用5 - 10 mL过夜培养的菌液，同时按照比例增加Buffer P1、Buffer P2、Buffer P3的用量，洗脱缓冲液EB应在55℃水浴锅预热，同时在吸附和洗脱时可以适当的延长时间，以增加提取效率。其它步骤相同。
DNA产量低
菌种问题：菌种保存过程中存在质粒丢失现象，培养细菌前最好先划线活化，以稳定产量。细菌未充分裂解：细菌须在Buffer P1/RNase A中充分重悬，成团的细菌因无法裂解会降低产量。
试剂准备有误：Buffer P2若有沉淀析出需加热溶解。Buffer PW2加入乙醇体积不准确(乙醇浓度需控制在80%)。
长片段质粒DNA：长片段质粒常以中低拷贝数为主，可提升菌液用量至10 mL以提高产量。将EB预热至55℃，并重复二次洗脱。
基因组污染
培养时间太长：菌液培养时间需控制在12 - 16 h。
裂解问题：加入Buffer P2时，必须轻柔颠倒混匀；处理多个样品时，加入Buffer P2时算起，总时间不要超过5 min。
下游结果不理想
盐污染：确保用Buffer PW2洗涤两次。
乙醇污染：在最后一次Buffer PW2洗涤后可将吸附柱离心时间由原来1 min增加至2 min。
质粒降解：用endA+的菌株如HB101或其它野生型菌株，含有高丰度的核酸酶，必须加入Buffer PW1。
膜脱落：在洗脱质粒时硅胶膜在离心过程中可能会发生脱落。10,000 rpm(11,500 × g)离心2 min后再把质粒转移至新的离心管中。
实验结果示例
版本：V231009
