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新型基因编辑肿瘤模型 — 多快好省

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发表时间:2024-01-23 09:23作者:守正弘药
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背景




恶性肿瘤导致的死亡已经成为第二顺位死亡原因,占比23.87%。近二十年来,肿瘤的临床治疗取得突破性进展,但仍有很多患者无法得到有效治疗。深入了解肿瘤发生机制,找到其中的关键作用因子,进而研发更加有效的治疗手段,显得尤为迫切。而肿瘤动物模型在探究肿瘤发生发展机制、研发新药物上扮演着至关重要角色。
常用的动物肿瘤模型包括:移植瘤模型(同种移植、异种移植和PDX)、诱导肿瘤模型(物理、化学和生物因素诱导)、自发肿瘤模型和基因编辑肿瘤模型。基因编辑肿瘤模型遗传背景清晰、类似人体内肿瘤的发生过程,因此备受研究者青睐。

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图1. 不同类型肿瘤模型简介

最常见的基因编辑肿瘤模型为在受精卵或胚胎干细胞中进行基因改造,敲入癌基因或者敲除抑癌基因,从而获得可以遗传的基因编辑动物。例如KPC基因编辑小鼠,在胰腺中过表达KRAS基因和敲除p53基因从而诱发胰腺癌。传统基因编辑动物的构建比较复杂,繁育周期也长,不容易实现大批量造模。而且存在费用高,成瘤时间长等问题。

另外,有一种专门制作肝癌的基因编辑肿瘤模型。该模型通过尾静脉快速注射大体积的质粒溶液,溶液瞬间大量冲入肝脏,使肝细胞受损,质粒进入肝细胞内。质粒溶液能够聚集在肝脏的原因为:由于注射体积过大、速度过快,溶液无法及时被心脏泵出,使得肝门静脉压力增大。过大的血压加上肝脏松软的结构,使得溶液快速流入肝脏。质粒通过囊泡内吞或者细胞膜孔进入细胞质,然后通过核孔进入细胞核。质粒溶液中包含一个有编码转座酶的质粒和另外一个或两个携带癌基因/抑癌基因干扰序列转座子的质粒,转座酶表达后将癌基因/抑癌基因干扰序列插入到染色体上实现长期表达,最终诱发肝癌发生。该方法简单、快捷、成本低,并且实现在体细胞进行基因编辑。缺点是只能形成肝癌,无法在其他器官或组织形成肿瘤1-5(注:本公司技术团队使用此方法已发表大量文章,拥有丰富的经验。)

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图2. 高压尾静脉注射质粒造肝癌模型结果展示

原理




众所周知,质粒很难在动物体内发生转染,一般需要电转或者通过病毒转染等方式。上述肝癌造模方法也是通过尾静脉快速注射大体积质粒溶液来提高转染效率。有文献报道在肺、甲状腺、肌肉、皮肤等组织或器官中直接注射质粒,也可以发生较低效率的转染。但由于转染效率太低,成功转染质粒的细胞很少,而且只能短时间表达基因,因此无法用于动物造模。动物自然发生肿瘤一般是少量细胞基因组发生基因突变,日积月累诱发癌变,最终大量扩增形成肿瘤。因此,本公司发明了一种直接注射包含癌基因/抑癌基因抑癌序列的质粒溶液,从而模拟动物自然发生肿瘤的模型构建方法(申请号:202311028166X)。该方法一次性注射大量质粒,以弥补转染效率低的问题,保证有部分细胞能够转染成功。除了注射含目的基因的质粒外,同时还注射含转座酶基因的质粒。转座酶表达后将目的基因插入染色体,实现基因组发生基因突变。

造模方法




a. 将癌基因序列/抑癌基因抑制序列构建到含有转座酶识别位点的表达质粒上得到目的基因质粒;

b. 将构建的目的基因质粒以单个或多个组合与转座酶质粒按一定比例混合在特定溶液中;

c. 将混合好的质粒组合溶液原位注射到动物待造模器官或组织内;

d. 数周后可在造模器官或组织内注射部位形成原位原发肿瘤。

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图3. 新型基因编辑肿瘤模型造模示意图

结果




1. C57BL/6J小鼠胃原位注射Akt/Myc癌基因质粒组合,从第三周开始可以看见明显肿瘤,第四周和第五周肿瘤快速增长,成瘤率接近100%。

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图4. 小鼠胃部注射质粒溶液造模不同时间胃癌大体图

2. C57BL/6J小鼠不同器官原位注射Akt/Myc癌基因质粒组合,在结肠、肾脏、卵巢和胰腺中均可形成肿瘤。

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图5. 小鼠不同器官注射质粒溶液形成肿瘤图

3. Sprague-Dawley大鼠肝脏原位注射Akt/Myc癌基因质粒组合,三周左右后可以形成肝癌,且成瘤率较高。
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图6. 大鼠肝脏注射质粒溶液形成肝癌大体图

优势分析




此模型可模拟动物体内由于遗传改变导致正常细胞向肿瘤细胞转化的过程,能动态地表征肿瘤发生发展地过程,在基因层面、肿瘤微环境、肿瘤发展及病理生理等方面与肿瘤发生发展真实情况更加贴近。并且该构建方式具备效率高、耗时短,成本低,成瘤率高、可大量制备等优点,可以为科研人员节省大量时间和经费。该模型为探究肿瘤发生发展机制、寻找和优化新的肿瘤治疗方法提供了有利工具。

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表1.不同肿瘤模型优缺点比较



参考文献




1. Wang, C., Zheng, X., Zhang, J. et al. CD300ld on neutrophils is required for tumour-driven immune suppression. Nature 621, 830–839 (2023).

2. Zheng, C., Snow, B.E., Elia, A.J. et al. Tumor-specific cholinergic CD4+ T lymphocytes guide immunosurveillance of hepatocellular carcinoma. Nat Cancer 4, 1437–1454 (2023)

3. Tong, Yu; Wang, Fan; Li, Songling et al. Histone methyltransferase KMT5C drives liver cancer progression and directs therapeutic response to PARP inhibitors. Hepatology ():10.1097/HEP.0000000000000559, August 9, 2023.

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5. Anna Wuestefeld, Viktoriia Iakovleva, Shirlyn Xue Ling Yap et al. A Pro-Regenerative Environment Triggers Premalignant to Malignant Transformation of Senescent Hepatocytes. Cancer Res (2023) 83 (3): 428–440.
守正弘药(武汉)生物科技有限公司成立于2021年,由鼠来宝生物投资,创始团队包括华科多名教授和博士。经过三年发展,技术团队现有四十余人,其中超过40%拥有硕士或以上学历。公司于2023年通过国家高新技术企业认定,申请多项专利。
守正弘药在湖北鄂州及广东佛山共有实验基地3200平方米,已建立分子生物学实验平台、细胞技术平台及实验动物模型构建和评价平台三大医学研究技术平台。公司主营业务为科研单位和医药研发机构提供实验外包服务,包括动物和细胞造模、药效评价、分子和病理检测、毒理检测和药动药代分析等。如今已经建立细胞系100+,动物模型200+,服务客户1000+。

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