小鼠基因型鉴定试剂盒说明书
Mouse Genotyping Kit Manual
产品简介
本产品包含DNA粗提取及PCR扩增的整套试剂，适用于小鼠基因型快速鉴定。该产品可从小鼠尾巴、脚趾或耳朵等组织中快速提取基因组DNA，无需进行组织匀浆、DNA的抽提沉淀、吸附柱法或磁珠法纯化等操作，产物可直接用于PCR扩增，显著简化实验流程。
表1 基因型鉴定试剂盒产品明细
序号 | 组分 | YDG01-10 | YDG01-20 | YDG01-50 | YDG01-100 | 保存温度 |
1 | Lysis Buffer* | 0.5 mL | 1 mL | 2.5 mL | 5 mL | 室温 |
2 | Proteinase K | 30 μL | 60 μL | 150 μL | 300 μL | -20℃ |
3 | 2 × Taq Mix (with Dye) | 0.1 mL | 0.2 mL | 0.5 mL | 1 mL | -20℃ |
* 该组分低温时会出现结晶，37℃水浴加热或室温溶解至澄清透明状即可使用，后续置于室温保存。
操作流程
1. DNA提取
1.1 采样：鼠尾尖2~3 mm，鼠耳2~5 mm2，脚趾1枚。采样后若不立即进行样品消化，需保存于-20℃或更低温度，在消化前避免反复冻融。
1.2 消化液配制：每个样本按照47 μL Lysis Buffer和3 μL Proteinase K配制样本消化液。
1.3 样本消化：确保消化液完全浸没样本后，可选择以下方法进行样本的消化。
表2 消化方式
| 仪器 | 操作 |
方法一 | 烘箱 | 55℃过夜消化 |
方法二 | 恒温摇床 | 56℃，250 rpm消化10 min，涡旋混匀仪振荡10 s |
1.4 灭活：消化完成的样本，于PCR仪99 ℃处理10 min以灭活蛋白酶K，随后冷却至室温或4℃。
1.5 稀释：灭活完成的样本加130 μL的ddH2O以稀释DNA，随后混匀，2000 rpm离心1 min将消化剩余的毛发、骨头等固态杂质离心于管底，后续PCR试验取上清作为模板。
1.6 保存：提取的DNA产物可短期保存于4 ℃，长期可置于-20 ℃或更低温度，避免反复冻融。
2. PCR扩增
表 3 PCR体系
Reaction Component | Volume (µL) |
Genomic DNA | 1 |
2× Taq Mix (with Dye) | 10 |
Forward Primer (10 μmol/L) | 0.5 |
Reverse Primer ( 10 μmol/L) | 0.5 |
ddH2O | 补足至20 |
2.1 引物：上下游引物可预混到一起作为Primer mix，使用时加1 µL即可。
2.2 PCR mix：建议先配制预混液，即将ddH2O、2× Taq Mix和Primer mix预混。建议计算约5%富余量，例如100份样品配制105份试剂。
2.3 加样：将19 µL PCR mix分装至PCR八连管或96孔PCR板后，再分别加入1 µL DNA上清。
2.4 混匀：扣紧管盖或封膜后涡旋振荡5 sec，离心10 sec。
2.5 上机：使用普通PCR仪进行扩增。根据自身需求选择表4的Touchdown程序或表5的常规PCR程序。
表4 Touchdown程序
Step | Temp | Time | Note |
1 | 95 °C | 5 min | Denature |
2 | 95 °C | 20 sec | Step3: -0.5℃ per cycle decrease. Repeat steps 2-4 for 10 cycles |
3 | 60 °C | 20 sec |
4 | 68 °C | 1 min / 1 kb |
5 | 95 °C | 20 sec | Repeat steps 5-7 for 26 cycles |
6 | 55 °C | 20 sec |
7 | 72 °C | 1 min / 1 kb |
8 | 72 °C | 5 min | Post extension |
9 | 10 °C | 2 min | Hold |
表5 常规PCR程序
Step | Temp | Time | Note |
1 | 95 °C | 5 min | Denature |
2 | 95 °C | 20 sec | Repeat steps 2-4 for 35 cycles |
3 | ？* | 20 sec |
4 | 72 °C | 1 min / 1 kb |
5 | 72 °C | 5 min | Post extension |
6 | 10 °C | 2 min | Hold |
* 根据设计的引物选择合适的退火温度，通常为引物Tm值减5℃。
2.6 电泳：PCR产物可根据条带大小，选择不同浓度的凝胶进行电泳，后续根据电泳结果进行基因型分析。
