鼠来宝生物

一文搞懂Cre-loxP条件性基因编辑

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发表时间:2024-05-24 14:53作者:郑芒

大锤八十、小锤四十,但是学过生物的朋友都知道,基因不是你有钱就能敲……

很多基因的功能重要或广泛,常规的全身性基因敲除(constitutive knock out)可能导致胚胎死亡或普遍的功能变化,研究者无法或难以对其进行精确的基因功能研究。此时,条件性基因编辑技术应运而生。
条件性基因编辑(conditional gene editing)是一种在特定时间、空间或诱导条件下精确地调控基因表达或基因组编辑的技术。它使科学家能够精确地操纵基因,从而有很强针对性地研究基因的在不同生物过程中的功能,因而被广泛应用于生物学和医学研究中。
本文以Cre-loxP系统为例,详细介绍条件性基因编辑的意义、原理、种类、应用及注意事项,希望能协助科研工作者更好地运用这些强大的工具。


Cre剪切DNA片段的示意动画[1]


一、条件性基因编辑的意义

条件性基因编辑的特征是能够在特定时间和特定空间精确控制基因功能,其优势主要体现在以下方面:

1) 避免胚胎致死

许多基因在胚胎发育过程中起着至关重要的作用。全身性敲除这些基因通常会导致胚胎致死,无法获得成活的个体,进而无法研究这些基因在成体中的功能。条件性基因编辑允许科学家在特定时间点或特定组织中敲除基因,从而绕过胚胎致死的问题。

例如:敲除小鼠胚胎发育过程中必需的基因Pten会导致胚胎死亡,而使用条件性基因编辑在成年小鼠的特定组织中敲除Pten,可以研究其在肿瘤发生中的作用 (Groszer, M., 2001)[2]

2) 减少非特异性效应

全身性敲除一个基因可能会引起广泛的生理变化,掩盖了研究目标基因在特定组织或细胞类型中的功能。条件性基因编辑可以在特定组织中敲除基因,减少非目标组织中的影响,从而更加明确地研究目标基因的功能。比如在研究肝脏疾病时,使用条件性基因编辑技术仅在肝细胞中敲除目标基因,可以避免对其他器官如心脏、肾脏等造成不必要的影响 (Smedley, D., 2016)[3]

3) 有利于研究基因相互作用

在多基因研究中,条件性基因编辑可以用来研究基因之间的相互作用。例如,通过在不同的时间点或不同的组织中敲除多个基因,可以研究这些基因在发育过程或生理功能中的相互作用。或者,在研究复杂疾病如糖尿病时,可以使用条件性基因编辑技术在同一小鼠模型中分别操纵胰岛素基因和糖代谢相关基因,创建更接近人类疾病的模型 (Magnuson, M. A., 2009)[4]

4) 时间特异性允许更真实地模拟人类疾病

许多人类疾病是由特定基因在特定组织或特定时间点的突变引起的,而非天生携带。条件性基因编辑系统的诱导型版本(详见下文“诱导型Cre”)允许科学家选择在合适的时机引入外界干预以激活或敲除基因,在动物模型中精确复制这些突变,从而更真实地模拟人类疾病,帮助研究疾病机制和开发治疗方法。例如,在癌症研究中,利用条件性基因编辑技术在成年小鼠的乳腺细胞中激活致癌基因Myc,从而诱导乳腺癌的发生 (Gunther, E. J., 2003)[5]。通过研究这些小鼠,科学家可以了解Myc在乳腺癌中的具体作用机制。


二、条件性基因编辑的原理

实现条件性基因编辑的技术基础是特异启动子位点特异重组系统,本文将详细介绍后者

1) 位点特异重组系统

位点特异重组系统(site-specific recombination system)是一种通过特定酶在基因组特定位点上进行DNA重组的技术,可以实现基因的插入、删除、反转和易位。

以下是几个常用的位点特异重组系统:
A. Cre-loxP:该系统最早发现于噬菌体P1中,是目前应用最广泛的条件性基因编辑工具 (Nagy, A. 2000)[6]。噬菌体P1是一种感染大肠杆菌的病毒,其基因组中包含了一种名为Cre(Causes Recombination)的重组酶和特定的DNA序列loxP(Locus of crossing over (x) in P1)。
Cre酶是一个由343个氨基酸组成的38kDa蛋白。
loxP位点是一个34个碱基对长的DNA序列,由两个13个碱基对的反向重复序列一个8个碱基对的间隔序列组成。

Cre重组酶能够识别并结合loxP位点,诱导位于这两个位点之间的DNA重组。这一发现最初是为了理解噬菌体在宿主细胞中如何复制和重组,但后来被应用于哺乳动物细胞中的基因工程,成为现代分子生物学中的重要工具。
B. Dre-rox:源自海洋细菌的D6噬菌体,Dre重组酶识别并诱导rox位点之间的重组。
C. Flpo-FRT:源自酵母的Flp重组酶,识别并诱导FRT位点之间的重组。
D. Vika-vox:源自白喉毒素噬菌体Vika。Vika重组酶识别并诱导vox位点之间的重组。

这些系统的工作原理类似,但其识别位点不同,互相不发生交叉反应 (Karimova M, 2018)[7],可联合应用,进行更灵活多样的基因编辑。

E. PhiC31系统:由PhiC31整合酶和其识别的位点(attP和attB)组成 (Yu, Y., 2014)[8] 。PhiC31整合酶可以介导attP和attB位点之间的定向重组,形成attL和attR位点。

F. Bxb1系统:由Bxb1整合酶和其识别位点(attP和attB)组成,类似于PhiC31系统。Bxb1整合酶也可以介导attP和attB位点之间的定向重组。

2) Cre-loxP系统的分子机制

Cre-loxP重组机制概览示意 (Tian, X., 2021)[9]

A. 识别与结合

两个Cre重组酶分子首先识别并分别结合loxP序列的两个反向重复序列,形成一个二聚体(Guo, F., 1997)[10]

B. 四聚体形成

两个前一步骤形成的二聚体互相靠近,最终形成由四个Cre分子与两个loxP位点结合形成的四聚体复合物。

C. DNA切割与交换

Cre重组酶在每个loxP位点的间隔序列中引导单链切割,产生带有3’端羟基的断裂。每个loxP位点的两个单链分别被切割。切割产生的自由3’端与对侧的3’端进行交换和重连,形成Holliday交叉结构(一种DNA中间体)。

D. 分子重组与解旋

Holliday交叉结构通过Cre酶的作用被解旋并重组,最终形成新的重组产物。这个过程导致两个loxP位点之间的DNA序列被删除、反转或易位,具体效果取决于loxP序列的排列方式(方向和位置)。

3) Cre-loxP系统的编辑效果

A. 删除(Deletion):当两个loxP位点在同一DNA链上并且同向排列时,Cre重组酶会删除两个loxP位点之间的DNA序列,并将剩余的DNA片段重新连接。这个过程几乎是不可逆的,也是最常用的方式。

B. 反转(Inversion):当两个loxP位点在同一DNA链上但反向排列时,Cre重组酶会使两个loxP位点之间的DNA片段发生180度反转。这个过程是可逆的。

比如在流行的荧光示踪品系Brainbow-2.0版本中(Livet, J., 2007)[11],两个反向的loxP位点的重组会使原本表达的RFP(在胞浆的红色荧光蛋白)转变为M-CFP(膜定位的青色荧光蛋白)。

C. 易位(Translocation):两个loxP位点位于不同的DNA链或染色体上,Cre重组酶会使两个loxP位点左右两侧的DNA片段发生互换易位。易位过程是可逆的,该方式运用较少。


三、Cre-loxP的种类

自其发现以来,野生型Cre-loxP系统经过了多项改进,产生了丰富的突变版本,以提高其在不同生物体或不同条件下的应用效率和特异性。

1) 序列优化的loxP

科学家对loxP位点序列进行了优化,使其在不同生物体内的识别和切割效率更高。改良的loxP位点还可以通过不同的组合,实现更复杂的基因重组。

间隔区域的N代表可变碱基,形成不同突变体,其序列方向决定了loxP的方向。

loxP突变体示例 (来自Missirlis P.I., 2006)

loxP野生型及各突变体之间相互交叉反应弱,即需同一种序列成对存在才能高效重组 (Missirlis P.I., 2006)[12]。例如,在荧光示踪品系Brainbow-1.1版本中(Livet, J., 2007),三对loxP变体(loxP及loxN、lox2272)序列互不交叉反应,不同细胞中随机发生loxP变体的各自重组,表达不同颜色的荧光蛋白以标记细胞。

Brainbow-1.1利用不同loxP版本产生多种荧光

2) 序列优化的Cre

iCre酶(improved Cre recombinase)是一种优化版本的Cre重组酶,通过改进其核酸序列和蛋白结构,提高了其在哺乳动物细胞中的表达和活性 (Shimshek, 2002)[13]

3) 诱导型Cre

诱导型Cre(inducible Cre)系统提供了多种灵活的基因编辑手段,使得研究人员能够在特定时间和空间精确调控基因功能。不同类型的诱导型Cre系统各有优缺点,中国学者Xueying Tian和Bin Zhou对此发表了高质量的综述 (Tian, X., 2021),研究人员可以根据具体实验需求选择合适的系统。

CreER

描述:CreER(Cre-Estrogen Receptor) 是Cre重组酶和雌激素受体 (estrogen receptor, ER) 的融合蛋白。未添加诱导剂时,表达的CreER与HSP90蛋白结合,定位于胞浆,无法进入细胞核编辑基因组DNA。只有在添加诱导剂(此处为一种雌激素受体拮抗剂Tamoxifen(他莫昔芬)或4-OHT(4-羟基他莫昔芬))后,诱导剂结合到CreER蛋白上,CreER才会通过构象变化从锚定蛋白 HSP90解离下来,进入细胞核,识别loxP位点并发生重组。通过控制诱导剂的注射时间,可以实现对基因重组的时间特异性调控。

优点:能够实现时间特异性和组织特异性的基因编辑。操作简便,适用于体内和体外实验。

缺点:需要使用他莫昔芬诱导,有时可能存在剂量控制和非特异性效应的问题。

MerCreMer

描述:MerCreMer是由两个鼠源雌激素受体(murine oestrogen receptor, MER)结合域和Cre重组酶组成的融合蛋白 (Zhang, Y., 1996)[14]。未添加诱导剂时,MerCreMer处于不活跃状态。通过添加他莫昔芬,两个雌激素受体结合域同时被激活,Cre重组酶得以活化并转入细胞核,诱导loxP位点之间的重组。
优点:提供更加严格的诱导控制,需要更高剂量的他莫昔芬来激活,从而减少了背景活性。

缺点:需要较高剂量的他莫昔芬,可能导致激素相关的副作用;由于双重雌激素受体结合,诱导过程可能稍慢。

CreERT2

描述:为了避免内源雌激素的干扰,在雌激素受体的配体结合区做一个点突变(G521R)得到CreERT。可以使CreER只响应外源的人工合成雌激素(如Tamoxifen他莫西芬、4-OHT [4-羟基他莫西芬])的诱导。而CreERT2是CreERT的进一步改良版本,含有3个点突变C400V/M453A/L544A,其对他莫昔芬的响应更加灵敏和快速 (Indra, A. K., 1999)[15]
优点:CreERT2具有比CreER更高的诱导效率和特异性,且对他莫昔芬的剂量需求较低,减少了非特异性效应的风险。

缺点:与CreER相似,需要使用他莫昔芬进行诱导,可能会有激素相关的副作用。

TetON-Cre/TetOFF-Cre

描述:TetON/TetOFF是一种基于四环素的可诱导基因表达系统,可与Cre-loxP系统结合使用。TetON系统在存在四环素(或其类似物如多西环素)时激活基因表达,而TetOFF系统则在四环素存在时抑制基因表达。将Cre-loxP与TetON/TetOFF系统结合,可以实现更精细的基因表达调控(Urlinger S., 2000) [16]
优点:能够通过四环素或多西环素实现时间和剂量可控的基因编辑。适用于长期实验,且诱导剂容易控制。

缺点:需要连续给药以维持Cre的表达或抑制,可能存在药物相关的副作用。

TetON-Cre示例

Split-Cre(分割型Cre)

描述:Split-Cre系统将Cre重组酶分为两个不活跃的部分(CreN和CreC),分别由不同的诱导条件控制。只有当两个部分同时存在并结合时,Cre重组酶才活化并发挥作用 (Wang, X., 2011)[17]
优点:提供更高的特异性和精确度,可以在更复杂的条件下实现基因编辑。

缺点:需要更复杂的诱导条件和表达系统,实验设计和操作相对较复杂。

光激活Cre

描述:光激活Cre(light-inducible Cre)是通过光照来激活的一类Cre重组酶。通常使用光敏蛋白与Cre融合,在特定波长的光照下,光敏蛋白改变构象,从而激活Cre (Taslimi A., 2016)[18]
优点:能够实现高时间分辨率的空间特异性基因编辑,通过光照的精确控制进行诱导,无需化学诱导剂。
缺点:需要特定设备(如LED光源)进行光照控制,且光的穿透深度有限,适用于浅表组织或体外实验。

总之,丰富多样的Cre改进版本赋予了研究者更多的自由度。更完整和详细的介绍(比如自剪切的诱导型CreER (sCreER)等),请参考Xueying Tian和Bin Zhou的综述 (Tian, X., 2021)。


四、Cre-loxP的应用

Cre-loxP系统在生物学和医学研究中有广泛的应用,可以归纳为如下主要用途:

1) 条件性基因敲除(conditonal knock out, CKO)

通过选择特异启动子(promoter),可以控制仅在特定组织或时间表达Cre重组酶,进而敲除flox目标基因,从而研究基因在特定组织或时间阶段的功能。例如,在小鼠模型中,通过在肝脏特异性表达Alb-Cre,可以敲除肝脏中的目标基因B-flox,研究B基因在肝脏中的作用。

2) 诱导型条件性基因敲除(inducible conditional knock out)

将常规Cre酶替换为诱导型Cre表达系统(如CreER和CreERT2),可以在特定时间点灌喂或注射外源性激素(如他莫昔芬)诱导基因敲除,从而研究基因在不同发育阶段或生理状态下的功能。

3) 条件性基因敲入(conditional knock in, CKI)

将基因敲除模式稍作调整,Cre-loxP系统也可以用于基因敲入。在敲入模式中,STOP序列(转录终止元件)阻止目的基因表达,Cre通过重组loxP位点将STOP序列切除后、目的基因得以顺利表达,即实现了基因敲入效果。当然,基因敲入也可以采用诱导型,与前文诱导型基因敲除类似给药激活,不赘述。

条件性基因敲入的一个重要应用是进行特定组织或细胞的静态荧光/染色标记或动态示踪,我们在同期发表的公众号文章《Cre报告基因品系》对代表性小鼠品系有更详细的介绍,欢迎阅读。

mT/mG品系荧光标记的不同组织细胞膜


五、Cre-loxP小鼠使用注意事项

繁育Cre和loxP小鼠用于实验需要考虑多方面的因素,以确保实验结果的可靠性和一致性。以下是一些关键的注意事项:

1. 选择合适的Cre

组织特异性启动子:根据研究目标选择适当的Cre启动子(如Albumin-Cre用于肝脏特异性敲除,Vgat-Cre用于神经系统特异性敲除),避免非特异性表达和脱靶效应。

诱导型Cre:如需在特定时间点激活Cre重组酶,可以选择诱导型Cre(如CreERT2)并使用适当的诱导剂(如他莫昔芬)。

2. 繁育策略

1) 条件性基因敲入只需一步交配

Cre半合子转基因的表达水平应该足以实现flox基因的重组。由于技术所限,早期开发的Cre小鼠品系通常是随机转基因的,并不清楚精确的基因组插入位点。由于半合子小鼠存在一个野生型染色体,使用半合子而不是纯合子Cre基因型可能会最小化随机转基因插入的意外后果。
当其被繁殖到纯合子时,可能会干扰内源性小鼠基因。当Cre表达量高到足以影响细胞生理,或当Cre识别类似于loxP位点的基因组序列时,也可能出现Cre毒性。已有研究表明在没有loxp序列的情况下,高表达的Cre也可以在成纤维细胞、胃细胞和精子中损伤DNA (JAX, 2013)。
另外,flox基因的大量表达有时也会产生细胞毒性。因此,杂合Cre与杂合flox的重组小鼠往往是最合适的基因敲入实验对象。
2) 条件性基因敲除应避免Creflox位于同源染色体

Cre和flox若在同一条染色体,在不考虑概率极低的在适当位置发生染色体同源重组的情况时,将无法得到Cre阳性且flox纯合的子代,也就不能实现flox目标基因纯合敲除,会干扰基因功能分析。

所以在选择Cre和flox品系时,务必查阅品系资料,确保两者在不同染色体。若非实验需要,也尽量避免在性染色体,否则得到所需性别及基因型子代的概率减半,需要繁育更多的小鼠才能满足实验需求。

3) 条件性基因敲除需要两步交配

条件性基因敲除小鼠的繁育没有标准流程。实验者可以根据实际情况,比如Cre和flox品系的特性、需要的基因型小鼠数量、现用可繁育亲代数量和实验周期等,选择最合适的策略。一般建议使用半合子Cre小鼠配野生型小鼠来维持Cre品系,不过The Jackson Laboratory (JAX) 对于部分Cre品系也推荐了纯合配纯合的繁育方案,供研究者参考。
本文以提供Cre杂合及flox纯合亲代为例,说明条件性敲除小鼠的繁育步骤。
第一步:Cre阳性小鼠配flox/flox纯合小鼠。50%概率得到Cre阳性flox基因为半合子的子代,可称为Cre-lox小鼠 (JAX, 2011)[19]

第二步:Cre-lox小鼠再配flox/flox纯合小鼠。25%概率得到所需的Cre阳性、flox基因纯合子,其在目标组织是Cre阳性、flox基因纯合敲除的,即为实验鼠。其它基因型的子代可作为对照鼠。


 在进行小鼠繁育设计时,可根据最终需要的特定基因型小鼠数量,结合孟德尔遗传定律,倒推繁育需要使用的亲代小鼠数量。记住,由于小鼠每胎产仔数量有波动,较小数目子代的基因型分布在统计上不可能每次都严格符合孟德尔遗传定律,一定要留有容错的富余量。

此外,如果自然繁育难以在有限时间内得到所需数量的目标小鼠,可以考虑使用“体外受精-胚胎移植”(IVF-ET) 技术加快繁育进度。鼠来宝生物提供专业的小鼠体外受精快速扩繁服务,可以在短时间内得到出生日期非常接近的数百只新生小鼠,若有需要请联系我司销售。

3. 合理选择实验和对照鼠

实验鼠:Cre阳性、GeneX-flox基因纯合子,在特定组织的GeneX基因实现两条染色体完全敲除。

对照鼠可以有不同的类型,研究者可以根据需要选择,或者在项目初期都进行验证,后续选择一种最合适的基因型作为对照鼠。
A (flox对照):最常用的对照。GeneX-flox纯合、无敲除,与实验小鼠对比评估GeneX敲除的表型变化,不过没有考虑Cre本身对表型的影响;
B (Cre对照):验证Cre本身是否导致表型变化,如Myh6-Cre有细胞毒性和心脏异常;
C (杂合敲除对照):评估GeneX杂合敲除的表型,较少使用。

4. 基因型验证

PCR检测:在繁育每一代小鼠后,通过PCR(或Southern blot,但已很少用)检测子代的基因型,以确保Cre和loxP基因的正确传递。通常需要使用两个独立的PCR反应,一个检测Cre基因,另一个检测loxP位点。

阳性、阴性和空白对照:在PCR实验中,使用合适对照以确保结果的准确性。阳性对照通常是已知含有Cre和loxP位点的小鼠DNA,阴性对照则是不含这些位点的小鼠DNA。空白对照以去离子水代替DNA,用于监测PCR是否受到核酸污染(若扩出目的条带就是发生了污染)。

鼠来宝生物提供基因型鉴定试剂盒、鉴定服务和技术支持,若有关于基因型鉴定的问题,欢迎联系我们。

5. 其它注意事项

1) Cre活性可能受到来自母系或父系的影响

Cre活性可能会根据转基因是从雄性还是雌性亲本遗传而有所不同 (JAX, 2013)[20]。例如,EIIa-Cre (B6.FVB-Tg(EIIa-cre)C5379Lmgd/J, JAX:003724) 的Cre在整个小鼠中表达,因此可以将floxed等位基因转化为完全敲除的等位基因,但当从母系传递时效率显著更高。Camk2a-Cre (B6.Cg-Tg(Camk2a-cre)T29-1Stl/J, JAX:005359) 在海马体中表达,但也在雄性生殖细胞中有表达。亲本遗传模式并不是对所有Cre品系都很重要,但值得考虑比较从母系和父系传递Cre基因所获得的结果。

2) 诱导型Cre可能会泄漏

理论上在没有他莫昔芬时,CreER在细胞核外,无法重组loxP位点,但有例子表明一个胰腺特异性RIP-CreER和一个黑色素细胞特异性Tyr-CreERT2在没有诱导的情况下重组序列 (JAX, 2013)[20]

3) Cre-lox可用来构建组织或细胞类型特异的荧光示踪品系

如果你需要对某一些细胞类型进行荧光标记,可以将其与荧光报告基因品系交配,就可以在这些细胞中获得红色、绿色、黄色甚至彩虹色的荧光。如果更喜欢组织化学检测,也可以选择其他表达β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶或荧光素酶的报告基因品系。我们在同期发表的公众号文章《Cre报告基因品系》有更详细的介绍。
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鼠来宝生物拥有丰富的Cre小鼠品系,可以使用体外受精技术快速繁殖出大量子代。也可以从头构建基因编辑小鼠,或者开展动物实验,并且提供基因型鉴定试剂盒及鉴定服务,感兴趣的读者请联系我们。


参考资料

1.University of Rochester. Biochemistry (Bio250) - Cre Recombinase. https://www.youtube.com/watch?v=zOStRhccn6M

2.Groszer M, et al. (2001). Negative regulation of neural stem/progenitor cell proliferation by the Pten tumor suppressor gene in vivo. Science, 294(5549), 2186-2189.

3.Smedley, D., Sidow, A., & Verzi, M. P. (2016). Conditional knockout strategies in the era of genome editing. Briefings in Functional Genomics, 15(5), 362-372.

4.Magnuson, M. A., Osipovich, A. B., & Guz, Y. (2009). Pancreatic β-cell-specific Cre driver line, Pdx1-CreERTM, for studying genetic mouse models of diabetes. Islets, 1(2), 92-94.

5.Gunther, E. J., et al. (2003). Impact of p53 loss on reversal and recurrence of conditional Wnt-induced tumorigenesis. Genes & development, 17(4), 488-501.

6.Nagy, A. (2000). Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis, 26(2), 99-109.

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8.Yu, Y., Tong, Q., Li, Z. et al. (2014). Improved site-specific recombinase-based method to produce selectable marker- and vector-backbone-free transgenic cells. Sci Rep 4, 4240. https://doi.org/10.1038/srep04240

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10.Guo, F., Gopaul, D.N., Van Duyne, G.D. (1997). Crystal structure of the Cre recombinase complexed with DNA in a site-specific recombination synapse. Science, 275(5298), 104-109.

11.Livet, J., et al. (2007). Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature, 450(7166), 56–62. https://doi.org/10.1038/nature06293

12.Missirlis PI, Smailus DE, Holt RA. A high-throughput screen identifying sequence and promiscuity characteristics of the loxP spacer region in Cre-mediated recombination. BMC Genomics. 2006;7:73. Published 2006 Apr 4. doi:10.1186/1471-2164-7-73

13.Shimshek, D. R., et al. (2002). Codon-improved Cre recombinase (iCre) expression in the mouse. Genesis (New York, N.Y. : 2000), 32(1), 19–26. https://doi.org/10.1002/gene.10023

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16.Urlinger, S., et al. (2000). Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators: novel mutations yield expanded range and sensitivity. PNAS, 97(14), 7963-7968. doi:10.1073/pnas.97.14.7963

17.Wang, X., & Le, T. Q. (2011). Split-Cre technology: improvements and applications. Genesis, 49(9), 704-712. doi:10.1002/dvg.20745

18.Taslimi, A., et al. (2016). Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase. Nature Chemical Biology, 12(6), 425-430. doi:10.1038/nchembio.2063

19.JAX, Peter Kelmenson. (2011). Cre Lox Breeding for Beginners, Part 1. https://www.jax.org/news-and-insights/jax-blog/2011/september/cre-lox-breeding

20.JAX. (2013). 12 things you don't know about Cre-lox. https://www.jax.org/news-and-insights/jax-blog/2013/september/a-dozen-facts-you-didnt-know-about-cre-lox





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