大锤八十、小锤四十，但是学过生物的朋友都知道，基因不是你有钱就能敲……

Cre剪切DNA片段的示意动画^[1]

一、条件性基因编辑的意义

条件性基因编辑的特征是能够在特定时间和特定空间精确控制基因功能，其优势主要体现在以下方面：

1) 避免胚胎致死

例如：敲除小鼠胚胎发育过程中必需的基因Pten会导致胚胎死亡，而使用条件性基因编辑在成年小鼠的特定组织中敲除Pten，可以研究其在肿瘤发生中的作用 (Groszer, M., 2001)^[2]。

2) 减少非特异性效应

全身性敲除一个基因可能会引起广泛的生理变化，掩盖了研究目标基因在特定组织或细胞类型中的功能。条件性基因编辑可以在特定组织中敲除基因，减少非目标组织中的影响，从而更加明确地研究目标基因的功能。比如在研究肝脏疾病时，使用条件性基因编辑技术仅在肝细胞中敲除目标基因，可以避免对其他器官如心脏、肾脏等造成不必要的影响 (Smedley, D., 2016)^[3]。

3) 有利于研究基因相互作用

在多基因研究中，条件性基因编辑可以用来研究基因之间的相互作用。例如，通过在不同的时间点或不同的组织中敲除多个基因，可以研究这些基因在发育过程或生理功能中的相互作用。或者，在研究复杂疾病如糖尿病时，可以使用条件性基因编辑技术在同一小鼠模型中分别操纵胰岛素基因和糖代谢相关基因，创建更接近人类疾病的模型 (Magnuson, M. A., 2009)^[4]。

4) 时间特异性允许更真实地模拟人类疾病

许多人类疾病是由特定基因在特定组织或特定时间点的突变引起的，而非天生携带。条件性基因编辑系统的诱导型版本（详见下文“诱导型Cre”）允许科学家选择在合适的时机引入外界干预以激活或敲除基因，在动物模型中精确复制这些突变，从而更真实地模拟人类疾病，帮助研究疾病机制和开发治疗方法。例如，在癌症研究中，利用条件性基因编辑技术在成年小鼠的乳腺细胞中激活致癌基因Myc，从而诱导乳腺癌的发生 (Gunther, E. J., 2003)^[5]。通过研究这些小鼠，科学家可以了解Myc在乳腺癌中的具体作用机制。

二、条件性基因编辑的原理

实现条件性基因编辑的技术基础是特异启动子和位点特异重组系统，本文将详细介绍后者。

1) 位点特异重组系统

位点特异重组系统（site-specific recombination system）是一种通过特定酶在基因组特定位点上进行DNA重组的技术，可以实现基因的插入、删除、反转和易位。

这些系统的工作原理类似，但其识别位点不同，互相不发生交叉反应 (Karimova M, 2018)^[7]，可联合应用，进行更灵活多样的基因编辑。

E. PhiC31系统：由PhiC31整合酶和其识别的位点（attP和attB）组成 (Yu, Y., 2014)^[8] 。PhiC31整合酶可以介导attP和attB位点之间的定向重组，形成attL和attR位点。

F. Bxb1系统：由Bxb1整合酶和其识别位点（attP和attB）组成，类似于PhiC31系统。Bxb1整合酶也可以介导attP和attB位点之间的定向重组。

2) Cre-loxP系统的分子机制

Cre-loxP重组机制概览示意 (Tian, X., 2021)[9]

A. 识别与结合

B. 四聚体形成

C. DNA切割与交换

D. 分子重组与解旋

3) Cre-loxP系统的编辑效果

A. 删除（Deletion）：当两个loxP位点在同一DNA链上并且同向排列时，Cre重组酶会删除两个loxP位点之间的DNA序列，并将剩余的DNA片段重新连接。这个过程几乎是不可逆的，也是最常用的方式。

B. 反转（Inversion）：当两个loxP位点在同一DNA链上但反向排列时，Cre重组酶会使两个loxP位点之间的DNA片段发生180度反转。这个过程是可逆的。

比如在流行的荧光示踪品系Brainbow-2.0版本中（Livet, J., 2007）^[11]，两个反向的loxP位点的重组会使原本表达的RFP（在胞浆的红色荧光蛋白）转变为M-CFP（膜定位的青色荧光蛋白）。

三、Cre-loxP的种类

自其发现以来，野生型Cre-loxP系统经过了多项改进，产生了丰富的突变版本，以提高其在不同生物体或不同条件下的应用效率和特异性。

1) 序列优化的loxP

间隔区域的N代表可变碱基，形成不同突变体，其序列方向决定了loxP的方向。

loxP突变体示例 (来自Missirlis P.I., 2006)

loxP野生型及各突变体之间相互交叉反应弱，即需同一种序列成对存在才能高效重组 (Missirlis P.I., 2006)^[12]。例如，在荧光示踪品系Brainbow-1.1版本中（Livet, J., 2007），三对loxP变体（loxP及loxN、lox2272）序列互不交叉反应，不同细胞中随机发生loxP变体的各自重组，表达不同颜色的荧光蛋白以标记细胞。

Brainbow-1.1利用不同loxP版本产生多种荧光

2) 序列优化的Cre

iCre酶（improved Cre recombinase）是一种优化版本的Cre重组酶，通过改进其核酸序列和蛋白结构，提高了其在哺乳动物细胞中的表达和活性 (Shimshek, 2002)^[13]。

3) 诱导型Cre

诱导型Cre（inducible Cre）系统提供了多种灵活的基因编辑手段，使得研究人员能够在特定时间和空间精确调控基因功能。不同类型的诱导型Cre系统各有优缺点，中国学者Xueying Tian和Bin Zhou对此发表了高质量的综述 (Tian, X., 2021)，研究人员可以根据具体实验需求选择合适的系统。

CreER

描述：CreER(Cre-Estrogen Receptor) 是Cre重组酶和雌激素受体 (estrogen receptor, ER) 的融合蛋白。未添加诱导剂时，表达的CreER与HSP90蛋白结合，定位于胞浆，无法进入细胞核编辑基因组DNA。只有在添加诱导剂（此处为一种雌激素受体拮抗剂Tamoxifen（他莫昔芬）或4-OHT（4-羟基他莫昔芬））后，诱导剂结合到CreER蛋白上，CreER才会通过构象变化从锚定蛋白 HSP90解离下来，进入细胞核，识别loxP位点并发生重组。通过控制诱导剂的注射时间，可以实现对基因重组的时间特异性调控。

缺点：需要使用他莫昔芬诱导，有时可能存在剂量控制和非特异性效应的问题。

MerCreMer

缺点：需要较高剂量的他莫昔芬，可能导致激素相关的副作用；由于双重雌激素受体结合，诱导过程可能稍慢。

CreERT2

缺点：与CreER相似，需要使用他莫昔芬进行诱导，可能会有激素相关的副作用。

TetON-Cre/TetOFF-Cre

缺点：需要连续给药以维持Cre的表达或抑制，可能存在药物相关的副作用。

TetON-Cre示例

Split-Cre（分割型Cre）

缺点：需要更复杂的诱导条件和表达系统，实验设计和操作相对较复杂。

光激活Cre

总之，丰富多样的Cre改进版本赋予了研究者更多的自由度。更完整和详细的介绍（比如自剪切的诱导型CreER (sCreER)等），请参考Xueying Tian和Bin Zhou的综述 (Tian, X., 2021)。

四、Cre-loxP的应用

Cre-loxP系统在生物学和医学研究中有广泛的应用，可以归纳为如下主要用途：

1) 条件性基因敲除（conditonal knock out, CKO）

通过选择特异启动子（promoter），可以控制仅在特定组织或时间表达Cre重组酶，进而敲除flox目标基因，从而研究基因在特定组织或时间阶段的功能。例如，在小鼠模型中，通过在肝脏特异性表达Alb-Cre，可以敲除肝脏中的目标基因B-flox，研究B基因在肝脏中的作用。

2) 诱导型条件性基因敲除（inducible conditional knock out）

将常规Cre酶替换为诱导型Cre表达系统（如CreER和CreERT2），可以在特定时间点灌喂或注射外源性激素（如他莫昔芬）诱导基因敲除，从而研究基因在不同发育阶段或生理状态下的功能。

3) 条件性基因敲入（conditional knock in, CKI）

将基因敲除模式稍作调整，Cre-loxP系统也可以用于基因敲入。在敲入模式中，STOP序列（转录终止元件）阻止目的基因表达，Cre通过重组loxP位点将STOP序列切除后、目的基因得以顺利表达，即实现了基因敲入效果。当然，基因敲入也可以采用诱导型，与前文诱导型基因敲除类似给药激活，不赘述。

条件性基因敲入的一个重要应用是进行特定组织或细胞的静态荧光/染色标记或动态示踪，我们在同期发表的公众号文章《Cre报告基因品系》对代表性小鼠品系有更详细的介绍，欢迎阅读。

mT/mG品系荧光标记的不同组织细胞膜

五、Cre-loxP小鼠使用注意事项

繁育Cre和loxP小鼠用于实验需要考虑多方面的因素，以确保实验结果的可靠性和一致性。以下是一些关键的注意事项：

1. 选择合适的Cre

组织特异性启动子：根据研究目标选择适当的Cre启动子（如Albumin-Cre用于肝脏特异性敲除，Vgat-Cre用于神经系统特异性敲除），避免非特异性表达和脱靶效应。

诱导型Cre：如需在特定时间点激活Cre重组酶，可以选择诱导型Cre（如CreERT2）并使用适当的诱导剂（如他莫昔芬）。

2. 繁育策略

1) 条件性基因敲入只需一步交配

Cre和flox若在同一条染色体，在不考虑概率极低的在适当位置发生染色体同源重组的情况时，将无法得到Cre阳性且flox纯合的子代，也就不能实现flox目标基因纯合敲除，会干扰基因功能分析。

所以在选择Cre和flox品系时，务必查阅品系资料，确保两者在不同染色体。若非实验需要，也尽量避免在性染色体，否则得到所需性别及基因型子代的概率减半，需要繁育更多的小鼠才能满足实验需求。

3) 条件性基因敲除需要两步交配

在进行小鼠繁育设计时，可根据最终需要的特定基因型小鼠数量，结合孟德尔遗传定律，倒推繁育需要使用的亲代小鼠数量。记住，由于小鼠每胎产仔数量有波动，较小数目子代的基因型分布在统计上不可能每次都严格符合孟德尔遗传定律，一定要留有容错的富余量。

此外，如果自然繁育难以在有限时间内得到所需数量的目标小鼠，可以考虑使用“体外受精-胚胎移植”(IVF-ET) 技术加快繁育进度。鼠来宝生物提供专业的小鼠体外受精快速扩繁服务，可以在短时间内得到出生日期非常接近的数百只新生小鼠，若有需要请联系我司销售。

3. 合理选择实验和对照鼠

实验鼠：Cre阳性、GeneX-flox基因纯合子，在特定组织的GeneX基因实现两条染色体完全敲除。

4. 基因型验证

阳性、阴性和空白对照：在PCR实验中，使用合适对照以确保结果的准确性。阳性对照通常是已知含有Cre和loxP位点的小鼠DNA，阴性对照则是不含这些位点的小鼠DNA。空白对照以去离子水代替DNA，用于监测PCR是否受到核酸污染（若扩出目的条带就是发生了污染）。

鼠来宝生物提供基因型鉴定试剂盒、鉴定服务和技术支持，若有关于基因型鉴定的问题，欢迎联系我们。

5. 其它注意事项

1) Cre活性可能受到来自母系或父系的影响

Cre活性可能会根据转基因是从雄性还是雌性亲本遗传而有所不同 (JAX, 2013)^[20]。例如，EIIa-Cre (B6.FVB-Tg(EIIa-cre)C5379Lmgd/J, JAX:003724) 的Cre在整个小鼠中表达，因此可以将floxed等位基因转化为完全敲除的等位基因，但当从母系传递时效率显著更高。Camk2a-Cre (B6.Cg-Tg(Camk2a-cre)T29-1Stl/J, JAX:005359) 在海马体中表达，但也在雄性生殖细胞中有表达。亲本遗传模式并不是对所有Cre品系都很重要，但值得考虑比较从母系和父系传递Cre基因所获得的结果。

2) 诱导型Cre可能会泄漏

理论上在没有他莫昔芬时，CreER在细胞核外，无法重组loxP位点，但有例子表明一个胰腺特异性RIP-CreER和一个黑色素细胞特异性Tyr-CreERT2在没有诱导的情况下重组序列 (JAX, 2013)^[20]。

3) Cre-lox可用来构建组织或细胞类型特异的荧光示踪品系

鼠来宝生物拥有丰富的Cre小鼠品系，可以使用体外受精技术快速繁殖出大量子代。也可以从头构建基因编辑小鼠，或者开展动物实验，并且提供基因型鉴定试剂盒及鉴定服务，感兴趣的读者请联系我们。

参考资料

1.University of Rochester. Biochemistry (Bio250) - Cre Recombinase. https://www.youtube.com/watch?v=zOStRhccn6M

2.Groszer M, et al. (2001). Negative regulation of neural stem/progenitor cell proliferation by the Pten tumor suppressor gene in vivo. Science, 294(5549), 2186-2189.

3.Smedley, D., Sidow, A., & Verzi, M. P. (2016). Conditional knockout strategies in the era of genome editing. Briefings in Functional Genomics, 15(5), 362-372.

4.Magnuson, M. A., Osipovich, A. B., & Guz, Y. (2009). Pancreatic β-cell-specific Cre driver line, Pdx1-CreERTM, for studying genetic mouse models of diabetes. Islets, 1(2), 92-94.

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9.Tian, X., & Zhou, B. (2021). Strategies for site-specific recombination with high efficiency and precise spatiotemporal resolution. In Journal of Biological Chemistry (Vol. 296). American Society for Biochemistry and Molecular Biology Inc. https://doi.org/10.1016/j.jbc.2021.100509

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12.Missirlis PI, Smailus DE, Holt RA. A high-throughput screen identifying sequence and promiscuity characteristics of the loxP spacer region in Cre-mediated recombination. BMC Genomics. 2006;7:73. Published 2006 Apr 4. doi:10.1186/1471-2164-7-73

13.Shimshek, D. R., et al. (2002). Codon-improved Cre recombinase (iCre) expression in the mouse. Genesis (New York, N.Y. : 2000), 32(1), 19–26. https://doi.org/10.1002/gene.10023

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19.JAX, Peter Kelmenson. (2011). Cre Lox Breeding for Beginners, Part 1. https://www.jax.org/news-and-insights/jax-blog/2011/september/cre-lox-breeding

20.JAX. (2013). 12 things you don't know about Cre-lox. https://www.jax.org/news-and-insights/jax-blog/2013/september/a-dozen-facts-you-didnt-know-about-cre-lox